İzmir’in yeniden kurulması, Türkçe’de Büyük İskender diye bilinen Makedonyalı Alexandros’a bağlanır. Büyük İskender İran seferinin başlarında, İÖ. 334 yılında Pers İmparatorluğu’nun Anadolu’daki ordusunu yendikten sonra, ordularıyla Efes üzerine ilerlemişti. Bu harekat sırasında İzmir yöresine geldiğinde, söylenceye göre şimdiki Kadife kale civarında ilahi bir işaret almış ve kendisinden orada yeni bir Smyrna kenti kurması istenmişti. Kuracağı kente eski Smyrna’lıların soyundan gelenleri toplayarak yerleştirmesi de belirtilmişti. Bunun üzerine İskender, komutanlarına kentin yeniden kurulması için emir verdi. Kurulan kentin yerinde daha öncesine ait bir yerleşimin bulunduğu ve Kadifekale’nin yapıldığı alan civarında bir kutsal alanın varlığı hakkında, yine bazı rivayetler olduğu bilinmektedir. Ancak kentin kuruluşunun İskender’in önde gelen iki komutanı tarafından gerçekleştirildiği kabul edilmektedir. Bilindiği üzere Kadifekale bu dönemin bir hatırası olarak kentin üzerinde bir taç gibi durmaktadır. Kadife Kale aynı zamanda kentin iç kalesi konumundaydı. Ancak elbette bu kale, günümüze ilk yapıldığı dönemdeki özellikleriyle ulaşmamıştır. Kale Roma, Bizans, Beylikler ve Osmanlı dönemlerinde de kullanıldığı için bu dönemlerde geçirdiği tamirlerin izlerini taşımaktadır. Fakat kentin kuruluş hikayesinde yer alan bir unsur olduğundan dolayı, İzmir için son derece önemli bir anıt belgedir. Bu ikinci kuruluş yerinde kent, Kadife Kale yamaçlarından aşağıya, denize doğru uzanıyordu. Kentin varlığı yine deniz ticaretiyle yakından ilgiliydi. Çünkü kentin konumlandığı alan yüksek bir tepe, yani Kadife Kale’nin bulunduğu yer ile küçük bir koydan oluşan doğal bir liman arasında bulunuyordu. Kent esas olarak bu doğal limanın var ettiği bir yerleşim olacak ve geleceği bu limanın canlılığına göre şekillenecektir. Belirttiğimiz gibi, iç kale konumunda olan Kadife Kale ile liman arasında da kentin dış surları yer alıyordu. Kentin doğu surları Kadife Kale’den aşağıya bugünkü Basmane’ye iniyor ve oradan da denize paralel bir şekilde şimdiki Hisar cami’nin bulunduğu yere uzanıyordu. Kentin batısındaki surlar ise, yine Kadife kaleden başlıyor ve şimdiki Bayram yeri civarına uzanıyor, oradan da Hükümet konağı yakınlarından denize ulaşıyordu. Bu surların doğu ve batı yönünde bulunan her ikisinde de, kentin kapıları yer almaktaydı. İzmir İÖ. 3. yüzyıl başlarında Efeslilerin tavsiyesi üzerine on üçüncü üye olarak Ion kentleri arasındaki birliğe kabul edildi. Hellenistik dönemdeki savaşlar sırasında “özgür kent” statüsünü korumayı başardı. Ancak bu savaşlar sonunda, Ionia kıyı kentleri Bergama krallığının üstünlüğünü kabul etmek zorunda kaldılar. Bergama krallığına bağlı bir kent olarak İÖ. 133 yılına kadar yaşayan İzmir, bu yılda ölen Bergama kralı III. Attalos’un vasiyeti gereğince, krallık Roma İmparatorluğu’na katılınca, diğer Ion kentleriyle birlikte Roma topraklarının bir parçası oldu.